Nová referenční metoda IFCC pro měření glykovaného hemoglobinu (HbA1c)

Zpracovali: RNDr. Josef Kratochvíla, RNDr. Bedřich Friedecký


Referenční metoda IFCC pro stanovení hemoglobinu A1c byla navržena a validována mezilaboratorními experimenty v průběhu roku 2001. Poté byla předložena ke schválení národním společnostem klinické chemie a laboratorní medicíny a po schválení publikována v lednu 2002.
Metodu vypracovala pracovní skupina IFCC pro standardizaci HbA1c. Autorský kolektiv je složen z evropských, amerických a japonských autorů a metoda sama byla uveřejněna v časopise Clinical Chemistry and Laboratory Medicine 2002; 40(1):78-89.

 

1. Předmět měření - analyt – HbA1c
Stabilní adukt glukózy s N-terminální aminoskupinou valinu β–řetězce hemoglobinu
{ N-(1-deoxyfruktosyl) hemoglobin}

 

2. Izolace a hemolýza erytrocytů
Čerstvá lidská krev je stabilizována EDTA a erytrocyty izolovány centrifugací. Erytrocyty jsou promyty roztokem NaCl a ponechány s roztokem NaCl 4 hodiny k odstranění labilních Schiffových bází (pre-HbA1c). Hemolyzát je pak připraven naředěním. Lidské erytrocyty jsou odděleny, promyty a hemolyzovány ve vodě a skladovány v pufru o pH = 6,2.
Takto připravený čistý hemolyzát je skladován při -20°C. Při tomto způsobu skladování je stabilní minimálně 1 rok.

 

3. Enzymové štěpení hemoglobinu
Roztok hemoglobinu je hydrolyzován (1 mg celkového hemoglobinu s 50 µl enzymového štěpícího roztoku, směs je doplněna pufrem do 500 µl a ponechána po dobu 2 hod. při 37°C za stálého mírného třepání) endoproteinázou Glu-C na různé Hb peptidy mezi nimiž jsou i glykovaný hexapeptid,odpovídající přítomnosti glykovaného hemoglobinu HbA1c a neglykovaný hexapeptid, odpovídající přítomnosti neglykovaného hemoglobinu HbAo.

Glykovaný hexapeptid má strukturu Glukóza-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu
Neglykovaný hexapeptid má strukturu Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu

 

4. Analytické měření
Směs peptidů je separována:

  1. Postupem HPLC-ESI/MS (kombinace vysokoúčinné kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie s ionizací elektrosprayí) za použití on-line propojení obou separačních systémů. Oba hexapeptidy jsou separovány ze směsi peptidů a poté kvantifikovány na podkladě rozdílných hodnot m/z. Z poměru hodnot m/z vzorků a kalibrátorů se počítá hodnota HbA1c.
  2. Postupem HPLC-CE (kombinace vysokoúčinné kapalinové chromatografie a kapilární elektroforézy). První separační krok je proveden pomocí HPLC. Jednotlivé eluované frakce se sbírají. Poté se směs frakcí 16 -18 podrobí následné další separaci pomocí CE. Glykovaný a neglykovaný hexapeptid jsou odděleny na bázi různých elektromigračních časů a kvantifikovány spektrofotometrickou detekcí při 214 nm.

 

5. Kalibrace
Jako kalibrátor slouží směs čistých hemoglobinů HbA1c a HbA0. Hodnota hemoglobinu je v kalibrátorech stanovena referenční metodou Mezinárodní hematologické společnosti (ICHS). Používá se řady šesti kalibrátorů, pokrývajících rozsah koncentrace 0 až 15 % HbA1c.

 

6. Přesnost měření a nejistota výsledků
Opakovatelnost CV = 1,05 %
Reprodukovatelnost CV = 1,8 %
Kombinovaná standardní nejistota primárních kalibrátorů je 0,63 %
Predikovaná nejistota hodnot sekundárních kalibrátorů je 1,2 %

 

7. Interference
Při referenční metodě nebyly zjištěny žádné významné interference karbamylovaného Hb, acetylovaného Hb ani geneticky anomálních izoforem HbS a HbC.

 

8. Prozatímní hodnota referenčního intervalu
Byla určena pomocí dánské populace 120 mužů a žen ve věkovém rozpětí 35 – 55 let (osoby bez přítomnosti diabetu). Výběr byl proveden dle kritérií WHO – ADA (fP-glukóza < 7 mmol.l-1 a standardní oGTT po dobu 2 hodin P-glukóza < 11,1 mmol.l-1).

 

3,33 % ±0,48 %
(neboli 2,85 % až 3,81 %)

 

Referenční interval není závislý na pohlaví. Jak je vidět z výše uvedeného je referenční interval dostatečně úzký oproti současným a jeho horní mez či cut-off je 3,81%, zatímco u současných rutinních metod odpovídá přibližně cut-off 5,0 až 6,2 %.

 

9. Referenční metoda IFCC a dosavadní prozatímní referenční metoda DCCT
Dosavadní referenční metoda DCCT (Diabetes Control and Complications Trial) je založena na použití metody HPLC Bio-Rex 70. Metoda DCCT je základem mezinárodních referenčních systémů měření a certifikace NGSP (National Glycohemaglobin Standardization Program USA) a ERL (European Reference Laboratory for HbA1c). Tyto systémy slouží k:

 

Referenční metoda IFCC je určena jako budoucí náhrada metody DCCT právě pro tyto uvedené účely. Protože nová (IFCC) a prozatímní (DCCT) referenční metoda poskytují zjevně významně odlišné výsledky, je velmi pravděpodobné, že dojde ke změnám v hodnotách kalibrátorů rutinních metod a následně i referenčních intervalů a terapeutických rozhodovacích limitů.


SEKK, 18.4.2002